Práctica 52: Prueba cruzada mayor. (PLXIV)(B4)
Fecha: 22-5-15
Prueba cruzada mayor.
Introducción:
-El objetivo de las pruebas pre-transfusionales es detectar las posibles reacciones antígeno-anticuerpo entre la sangre del donante y el receptor, antes de la transfusión. Para ello se realiza:
-Tipaje correcto de AB0 y Rh del donante y receptor.
-Escrutinio de los anticuerpos irregulares en el receptor.
-Prueba cruzada mayor.
Material:
-Tubos de hemólisis.
-Centrífuga.
-Pipetas pasteur.
-Gradilla.
-Reloj.
Reactivos:
-Suero salino al 0,9%.
-Albúmina bovina al 30%.
-Suero de Coombs.
Muestras:
-Suero del receptor.
-Hematíes lavados en suspensión de entre 2 y 5% del donante.
Fundamento:
-La práctica consiste ne enfrentar el suero del receptor con los hematíes del donante, primero en medio salino, posteriormente en medio albuminoso, y por último frente al suero de Coombs. Con este último paso detectaremos los anticuerpos que se hayan quedado fijados a la membrana eritrocitaria.
Procedimiento:
1. En un tubo de hemólisis depositamos 1 gota de suspensión del donante + 2 gotas de suero del receptor.
2. Mezclamos suavemente y dejamos reposar 2-3 minutos.
3. Centrifugamos a 2500rpm durante 1 minuto (3500rpm-30 segundos).
4. Leer los resultados, si aglutina, paramos, no son compatibles, si no aglutina, seguimos.
5. Añadimos 3 gotas de Albúmina bovina al 30% y mezclamos.
6. Incubamos a 37ºC durante 30 minutos.
7. Centrifugamos a 2500rpm durante 1 minuto(3500rpm-30 segundos).
8. Leer los resultados, si aglutina, paramos, no son compatibles, si no aglutina, seguimos.
9. Lavamos los hematíes x3 veces y retirar bien el sobrenadante.
10. Añadimos 1 gota de suero de Coombs y mezclamos.
11. Centrifugamos a 1000rpm durante 2 minutos.
12. Leer los resultados en el visualizador luminoso.
Lectura de los resultados:
- La ausencia de aglutinación en todos los pasos indica que el donante y el receptor son compatibles y por tanto, la transfusión es posible.
-Si aglutina en cualquier paso, son incompatibles.
Práctica 51: Determinación rápida de hemoglobina.(PLIV)(B2)
Fecha: 21-5-15
Determinación rápida de hemoglobina.
Introducción:
-Para determinar la concentración de hemoglobina justo antes de una donanción, es necesario un método rápido aun que no sea muy preciso.
-Esta determinación se basa en el hecho de que a sangre con una [Hb] superior a la permitida, para efectuar la donación, tiene una densidad mayor a la de una solución de sulfato de cobre.
Material:
-Gasas y lancetas.
-Vaso de precipitado.
Reactivos:
-Solución de sulfato de cobre con densidad = 1,054g/cm3 en varones y 1,052g/cm3 en mujeres.
-Alcohol.
-Agua destilada.
Muestra:
-Sangre capilar.
Fundamento:
-Para varones, el sulfato de cobre debe tener la d=1,054g/cm3 por que la concentración de una gota de sangre sin anemia debe ser superior a 13g/dl.
-Para mujeres el sulfato de cobre debe tener la d=1,052g/cm3 por que la concentración de una gota de sangre sin anemia debe ser superior a 12g/dl.
Procedimiento:
1. Preparar la solución de sulfato de cobre con d=1,052g/dl:
-Disolver 17g de sulfato de cobre en 100,74ml de agua destilada.
-Mezcla 51ml de la solución anterior con 49ml de agua destilada.
2. Depositar una cantidad de esta solución en un vaso de precipitado de 50ml por jemplo.
3. Desinfectar la zona de punción y depositar una gota de sangre con impulso sobre la solución de sulfato de cobre.
4. Observar si la gota cae o sobrenada.
Lectura de los resultados:
-Si la gota cae es porque es más densa que el sulfato, por lo tanto tiene una concentración superior a la de una gota con anemia.
-Si sobrenada es presencia de anemia.
Práctica 50: Determinación de un Du. (PLXII)(B4).
Fecha: 20-5-15
Determinación de un Du.
Introducción:
-En algunos casos los anticuerpos tipo IgG son incapaces de producir la aglutinación de los hematíes. Sin embargo, son capaces de adherirse a su superficie y decimos que han sensibilizado a los hematíes.
-El suero de Coombs, suero extraído de conegos con anticuerpos IgM humana, puede ser poliespecifico, si está dirigido contra la IgG y contra el componente C3d del complemento o monoespecífico, si está dirigido contra la IgG o contra alguno de los componentes del complento.
Material:
-Tubos de hemólisis.
-Centrífuga.
-Pipetas pasteur.
-Gradilla.
-Baño de agua.
-Reloj.
-Visualizador luminoso.
Reactivos:
-Suero anti-D humano.
-Suero antiglobulila humana (suero de Coombs).
-Suero salino.
Muestra:
-Hematíes de sangre problema previamente lavados y suspendidos a 5%.
Fundamento:
-El test de Coombs puede realizarse de dos maneras:
-Prueba directa: Intentamos detectar anticuerpos incompletos que han sensibilizado a los hematíes, los enfrentamos diréctamente al suero de Coombs y observamos.
-Prueba indirecta: Primero se sensibilizan los hematíes y luego los hacemos reaccionar con el suero de Coombs. Buscamos anticuerpos incompletos libres o poner de manifiesto la presencia de antígenos débiles en la membrana de los hematíes.
Procedimiento:
1. En un tubo de hemólisis vertimos una gota de suero anti-D y una gota de la suspensión de hematíes problema.
2. Mezclamos e incubamos a 37ºC durante 30 minutos.
3. De mientras podemos hacer un control negativo(para evitar falsos positivos), consiste un Coombs directo, se vierte una gota de la suspensión + una gota de suero de Coombs en un tubo de hemólisis, centrifugar a 1000rpm durante 1 minuto y ver los resultados.
4. Una vez incubada la muestra, lavamos la solución con 2ml de suero salino x3 veces a 1000rpm durante 1 minuto.
5. Decantamos el sobrenadante y añadimos una gota de suero de Coombs.
6. Centrifugamos a 1000rpm durante 1 minuto.
7. Leer los resultados.
Lectura de los resultados:
-Si existe aglutinación, el resultado es +, indíca que en la membrana de los hematíes hay antígenos Du y se clasifica la sangre como Rh+ variante Du. Si no existe aglutinación, se considera Rh -.
Práctica 49: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Fecha: 13,14 y 15 de mayo de 2015
16. Preparar un gel de Agarosa, pesar 1,5g de agarosa en polvo y mezclar con 27 ml de agua destilada y 10ml de tampón TAE.
17. Mezclar y calentar en el microondas hasta que desaparezca por completo la turbidez.
18. Dejar enfriar y vertir 5microlitros de colorante.
19. Vertir la mezcla en la bandeja de electroforesis y poner el molde de los pocillos, dejar enfriar y retirar los moldes con cuidado.
20. Depositar en los pocillos de los extremos el control.
21. Como son 10 microlitros en total los que tenemos que depositar en cada pocillo, cogeremos 5microlitros de nuestro ADN ya amplificado + 5microlitros de tampón de carga.
22. Tapar la cubeta de electrofoseris y conectar a la corriente a 120 voltios durante 30 minutos.
23. Observar los resultados con luz ultravioleta con cuidado por que puede dañar la vista.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Introducción:
-La PCR es una técnica biología molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis. Su objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN (amplificar), partiendo de un fragmento original, utilizándolo como molde.
-La utilidad que presenta es que tras la amplificación resulta más fácil con una alta probabilidad, la identificación de virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas o simplemente con fines divulgativos.
Material:
-Palillos.
-Tubos de ensayo.
-Gradillas.
-Eppendorf para PCR/ microtubos.
-Centrífuga de microtubo.
-Placa calefactora para microtubo.
-Micropipetas con punta de pipetas.
-Pipetas pasteur.
-Congelador.
-Termociclador.
-Matraz aforado.
-Vasos de precipitado.
-Varilla de vidrio.
-Microondas.
-Fuente de poder y Materiales para electroforesis.
-Visualizador de luz ultravioleta.
-Balanza.
-Vidrio de reloj y cucharilla.
Reactivos:
-Solución salina 0,9%.
-Resina InstaGene Matrix de Bioser.
-Tampón TAE.
-Gel de Agarosa en polvo.
-Oligonucleòtidos.
-PureTaq Ready To Go PCR.
-Marcador de peso molecular.
-Intercalante para ADN(Bromuro de etidio o similar, en clase, es lógico que no se utilizase este producto, debido a su alto nivel de mutagenidad, así que usaremos uno menos peligroso, en nuestro caso, fueron dos).
-Agua destilada.
Muestra:
-ADN procedente de la mucosa bucal.
Muestra:
-ADN procedente de la mucosa bucal.
Fundamento:
-Esta práctica tan laboriosa, consta principalmente de tres fases: Aislamiento de ADN, PCR y Electroforesis. El objetivo de esta práctica es demostrar la existencia de polimorfismo en un locus concreto mediante el método de amplificación por PCR.
Procedimiento:
1. Enjuagar la boca.
2. Con un palillo, intentaremos arrastrar la mayor parte dela mucosa de la boca, con cuidado de no hacernos daño.
3. Depositamos 5 ml de suero salino en un tubo de ensayo e introducimos el palillo por la parte de la mucosa y removemos durante unos tres minutos.
4. En un microtubo o un eppendorf depositamos 1,4ml de la solución anterior + 3ml de suero salino.
5. Centrifugamos a 8000rpm durante 5 minutos.
6. Decantamos el sobrenadante, evitando que se distorsione el precipitado celular.
7. Le añadimos 70microlitros al eppendorf con el precipitado de células y resuspendemos con la punta de micropipeta.
8. Incubamos la muestra en la placa calefactora a 100ºC durante 10 minutos.
9. Dejar enfriar a temperatura ambiente unos 2 minutos.
10. Centrifugamos a 1300rpm durante 30 segundos.
11. Tranferir 10 microlitros de sobrenadante a un eppendorf.
12. Se puede guardar la muestra en el congelador hasta el siguiente procedimiento.
13. Comenzaremos con la PCR, añadir a el eppendorf que contiene una bolita de Ready To Go:
-18,5 microlitros de agua destilada(a ser posible estéril).
-2 microlitros de oligo 1(Primers).
-3 microlitros de oligo 2(Primers).
-2,5 microlitros de ADN ya obtenido previamente.
14. Centrifugamos (Un toque).
15. Depositamos nuestro eppendorf en el termociclador y dejar que éste trabaje.
16. Preparar un gel de Agarosa, pesar 1,5g de agarosa en polvo y mezclar con 27 ml de agua destilada y 10ml de tampón TAE.
17. Mezclar y calentar en el microondas hasta que desaparezca por completo la turbidez.
18. Dejar enfriar y vertir 5microlitros de colorante.
19. Vertir la mezcla en la bandeja de electroforesis y poner el molde de los pocillos, dejar enfriar y retirar los moldes con cuidado.
20. Depositar en los pocillos de los extremos el control.
21. Como son 10 microlitros en total los que tenemos que depositar en cada pocillo, cogeremos 5microlitros de nuestro ADN ya amplificado + 5microlitros de tampón de carga.
22. Tapar la cubeta de electrofoseris y conectar a la corriente a 120 voltios durante 30 minutos.
23. Observar los resultados con luz ultravioleta con cuidado por que puede dañar la vista.
Lectura de los resultados:
-Se observaría una cosa así:
Si no te gusta leer, y prefieres algo más divertido, clicka en el siguiente video y te esplicará como realizar una PCR de manera divertida ;)
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