Práctica 52: Prueba cruzada mayor. (PLXIV)(B4)
Fecha: 22-5-15
Prueba cruzada mayor.
Introducción:
-El objetivo de las pruebas pre-transfusionales es detectar las posibles reacciones antígeno-anticuerpo entre la sangre del donante y el receptor, antes de la transfusión. Para ello se realiza:
-Tipaje correcto de AB0 y Rh del donante y receptor.
-Escrutinio de los anticuerpos irregulares en el receptor.
-Prueba cruzada mayor.
Material:
-Tubos de hemólisis.
-Centrífuga.
-Pipetas pasteur.
-Gradilla.
-Reloj.
Reactivos:
-Suero salino al 0,9%.
-Albúmina bovina al 30%.
-Suero de Coombs.
Muestras:
-Suero del receptor.
-Hematíes lavados en suspensión de entre 2 y 5% del donante.
Fundamento:
-La práctica consiste ne enfrentar el suero del receptor con los hematíes del donante, primero en medio salino, posteriormente en medio albuminoso, y por último frente al suero de Coombs. Con este último paso detectaremos los anticuerpos que se hayan quedado fijados a la membrana eritrocitaria.
Procedimiento:
1. En un tubo de hemólisis depositamos 1 gota de suspensión del donante + 2 gotas de suero del receptor.
2. Mezclamos suavemente y dejamos reposar 2-3 minutos.
3. Centrifugamos a 2500rpm durante 1 minuto (3500rpm-30 segundos).
4. Leer los resultados, si aglutina, paramos, no son compatibles, si no aglutina, seguimos.
5. Añadimos 3 gotas de Albúmina bovina al 30% y mezclamos.
6. Incubamos a 37ºC durante 30 minutos.
7. Centrifugamos a 2500rpm durante 1 minuto(3500rpm-30 segundos).
8. Leer los resultados, si aglutina, paramos, no son compatibles, si no aglutina, seguimos.
9. Lavamos los hematíes x3 veces y retirar bien el sobrenadante.
10. Añadimos 1 gota de suero de Coombs y mezclamos.
11. Centrifugamos a 1000rpm durante 2 minutos.
12. Leer los resultados en el visualizador luminoso.
Lectura de los resultados:
- La ausencia de aglutinación en todos los pasos indica que el donante y el receptor son compatibles y por tanto, la transfusión es posible.
-Si aglutina en cualquier paso, son incompatibles.
Práctica 51: Determinación rápida de hemoglobina.(PLIV)(B2)
Fecha: 21-5-15
Determinación rápida de hemoglobina.
Introducción:
-Para determinar la concentración de hemoglobina justo antes de una donanción, es necesario un método rápido aun que no sea muy preciso.
-Esta determinación se basa en el hecho de que a sangre con una [Hb] superior a la permitida, para efectuar la donación, tiene una densidad mayor a la de una solución de sulfato de cobre.
Material:
-Gasas y lancetas.
-Vaso de precipitado.
Reactivos:
-Solución de sulfato de cobre con densidad = 1,054g/cm3 en varones y 1,052g/cm3 en mujeres.
-Alcohol.
-Agua destilada.
Muestra:
-Sangre capilar.
Fundamento:
-Para varones, el sulfato de cobre debe tener la d=1,054g/cm3 por que la concentración de una gota de sangre sin anemia debe ser superior a 13g/dl.
-Para mujeres el sulfato de cobre debe tener la d=1,052g/cm3 por que la concentración de una gota de sangre sin anemia debe ser superior a 12g/dl.
Procedimiento:
1. Preparar la solución de sulfato de cobre con d=1,052g/dl:
-Disolver 17g de sulfato de cobre en 100,74ml de agua destilada.
-Mezcla 51ml de la solución anterior con 49ml de agua destilada.
2. Depositar una cantidad de esta solución en un vaso de precipitado de 50ml por jemplo.
3. Desinfectar la zona de punción y depositar una gota de sangre con impulso sobre la solución de sulfato de cobre.
4. Observar si la gota cae o sobrenada.
Lectura de los resultados:
-Si la gota cae es porque es más densa que el sulfato, por lo tanto tiene una concentración superior a la de una gota con anemia.
-Si sobrenada es presencia de anemia.
Práctica 50: Determinación de un Du. (PLXII)(B4).
Fecha: 20-5-15
Determinación de un Du.
Introducción:
-En algunos casos los anticuerpos tipo IgG son incapaces de producir la aglutinación de los hematíes. Sin embargo, son capaces de adherirse a su superficie y decimos que han sensibilizado a los hematíes.
-El suero de Coombs, suero extraído de conegos con anticuerpos IgM humana, puede ser poliespecifico, si está dirigido contra la IgG y contra el componente C3d del complemento o monoespecífico, si está dirigido contra la IgG o contra alguno de los componentes del complento.
Material:
-Tubos de hemólisis.
-Centrífuga.
-Pipetas pasteur.
-Gradilla.
-Baño de agua.
-Reloj.
-Visualizador luminoso.
Reactivos:
-Suero anti-D humano.
-Suero antiglobulila humana (suero de Coombs).
-Suero salino.
Muestra:
-Hematíes de sangre problema previamente lavados y suspendidos a 5%.
Fundamento:
-El test de Coombs puede realizarse de dos maneras:
-Prueba directa: Intentamos detectar anticuerpos incompletos que han sensibilizado a los hematíes, los enfrentamos diréctamente al suero de Coombs y observamos.
-Prueba indirecta: Primero se sensibilizan los hematíes y luego los hacemos reaccionar con el suero de Coombs. Buscamos anticuerpos incompletos libres o poner de manifiesto la presencia de antígenos débiles en la membrana de los hematíes.
Procedimiento:
1. En un tubo de hemólisis vertimos una gota de suero anti-D y una gota de la suspensión de hematíes problema.
2. Mezclamos e incubamos a 37ºC durante 30 minutos.
3. De mientras podemos hacer un control negativo(para evitar falsos positivos), consiste un Coombs directo, se vierte una gota de la suspensión + una gota de suero de Coombs en un tubo de hemólisis, centrifugar a 1000rpm durante 1 minuto y ver los resultados.
4. Una vez incubada la muestra, lavamos la solución con 2ml de suero salino x3 veces a 1000rpm durante 1 minuto.
5. Decantamos el sobrenadante y añadimos una gota de suero de Coombs.
6. Centrifugamos a 1000rpm durante 1 minuto.
7. Leer los resultados.
Lectura de los resultados:
-Si existe aglutinación, el resultado es +, indíca que en la membrana de los hematíes hay antígenos Du y se clasifica la sangre como Rh+ variante Du. Si no existe aglutinación, se considera Rh -.
Práctica 49: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Fecha: 13,14 y 15 de mayo de 2015
16. Preparar un gel de Agarosa, pesar 1,5g de agarosa en polvo y mezclar con 27 ml de agua destilada y 10ml de tampón TAE.
17. Mezclar y calentar en el microondas hasta que desaparezca por completo la turbidez.
18. Dejar enfriar y vertir 5microlitros de colorante.
19. Vertir la mezcla en la bandeja de electroforesis y poner el molde de los pocillos, dejar enfriar y retirar los moldes con cuidado.
20. Depositar en los pocillos de los extremos el control.
21. Como son 10 microlitros en total los que tenemos que depositar en cada pocillo, cogeremos 5microlitros de nuestro ADN ya amplificado + 5microlitros de tampón de carga.
22. Tapar la cubeta de electrofoseris y conectar a la corriente a 120 voltios durante 30 minutos.
23. Observar los resultados con luz ultravioleta con cuidado por que puede dañar la vista.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Introducción:
-La PCR es una técnica biología molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis. Su objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN (amplificar), partiendo de un fragmento original, utilizándolo como molde.
-La utilidad que presenta es que tras la amplificación resulta más fácil con una alta probabilidad, la identificación de virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas o simplemente con fines divulgativos.
Material:
-Palillos.
-Tubos de ensayo.
-Gradillas.
-Eppendorf para PCR/ microtubos.
-Centrífuga de microtubo.
-Placa calefactora para microtubo.
-Micropipetas con punta de pipetas.
-Pipetas pasteur.
-Congelador.
-Termociclador.
-Matraz aforado.
-Vasos de precipitado.
-Varilla de vidrio.
-Microondas.
-Fuente de poder y Materiales para electroforesis.
-Visualizador de luz ultravioleta.
-Balanza.
-Vidrio de reloj y cucharilla.
Reactivos:
-Solución salina 0,9%.
-Resina InstaGene Matrix de Bioser.
-Tampón TAE.
-Gel de Agarosa en polvo.
-Oligonucleòtidos.
-PureTaq Ready To Go PCR.
-Marcador de peso molecular.
-Intercalante para ADN(Bromuro de etidio o similar, en clase, es lógico que no se utilizase este producto, debido a su alto nivel de mutagenidad, así que usaremos uno menos peligroso, en nuestro caso, fueron dos).
-Agua destilada.
Muestra:
-ADN procedente de la mucosa bucal.
Muestra:
-ADN procedente de la mucosa bucal.
Fundamento:
-Esta práctica tan laboriosa, consta principalmente de tres fases: Aislamiento de ADN, PCR y Electroforesis. El objetivo de esta práctica es demostrar la existencia de polimorfismo en un locus concreto mediante el método de amplificación por PCR.
Procedimiento:
1. Enjuagar la boca.
2. Con un palillo, intentaremos arrastrar la mayor parte dela mucosa de la boca, con cuidado de no hacernos daño.
3. Depositamos 5 ml de suero salino en un tubo de ensayo e introducimos el palillo por la parte de la mucosa y removemos durante unos tres minutos.
4. En un microtubo o un eppendorf depositamos 1,4ml de la solución anterior + 3ml de suero salino.
5. Centrifugamos a 8000rpm durante 5 minutos.
6. Decantamos el sobrenadante, evitando que se distorsione el precipitado celular.
7. Le añadimos 70microlitros al eppendorf con el precipitado de células y resuspendemos con la punta de micropipeta.
8. Incubamos la muestra en la placa calefactora a 100ºC durante 10 minutos.
9. Dejar enfriar a temperatura ambiente unos 2 minutos.
10. Centrifugamos a 1300rpm durante 30 segundos.
11. Tranferir 10 microlitros de sobrenadante a un eppendorf.
12. Se puede guardar la muestra en el congelador hasta el siguiente procedimiento.
13. Comenzaremos con la PCR, añadir a el eppendorf que contiene una bolita de Ready To Go:
-18,5 microlitros de agua destilada(a ser posible estéril).
-2 microlitros de oligo 1(Primers).
-3 microlitros de oligo 2(Primers).
-2,5 microlitros de ADN ya obtenido previamente.
14. Centrifugamos (Un toque).
15. Depositamos nuestro eppendorf en el termociclador y dejar que éste trabaje.
16. Preparar un gel de Agarosa, pesar 1,5g de agarosa en polvo y mezclar con 27 ml de agua destilada y 10ml de tampón TAE.
17. Mezclar y calentar en el microondas hasta que desaparezca por completo la turbidez.
18. Dejar enfriar y vertir 5microlitros de colorante.
19. Vertir la mezcla en la bandeja de electroforesis y poner el molde de los pocillos, dejar enfriar y retirar los moldes con cuidado.
20. Depositar en los pocillos de los extremos el control.
21. Como son 10 microlitros en total los que tenemos que depositar en cada pocillo, cogeremos 5microlitros de nuestro ADN ya amplificado + 5microlitros de tampón de carga.
22. Tapar la cubeta de electrofoseris y conectar a la corriente a 120 voltios durante 30 minutos.
23. Observar los resultados con luz ultravioleta con cuidado por que puede dañar la vista.
Lectura de los resultados:
-Se observaría una cosa así:
Si no te gusta leer, y prefieres algo más divertido, clicka en el siguiente video y te esplicará como realizar una PCR de manera divertida ;)
Práctica 48: Determinación del fenotipo y genotipo del sistema Rh. (PLXI)(B4).
Fecha: 7-5-15
Determinación del fenotipo y genotipo del sistema Rh.
Introducción:
-El genotipo de una persona es su dotación genética en el cromosoma, y el fenotipo es la manifestación de ese genotipo. En caso de los sistemas del grupo sanguíneo se puede considerar el fenotipo como la suma total de antígenos detectados en los hematíes mediante el empleo de antisueros específicos.
Material:
- Tubos de hemólisis.
-Visualizador luminoso.
-Papel parafilm.
-Rotulador de vidrio.
-Pipetas pasteur.
-Centrífuga.
-Gradilla.
Reactivos:
-Suero anti-D.
-Suero anti-E.
-Suero anti-C.
-Suero anti-e.
-Suero anti-c.
-Suero fisiológico.
Muestra:
-Suspensión de hematíes lavados al 5% en solución salina.
Fundamento:
-Podemos investigar el genotipo del sistema Rh enfrentando los hematíes problema a distintos antisueros dirigidos contra los antígenos que componen el sistema Rh.
Procedimiento:
1. Rotulamos cinco tubos "D","C","E","c" y "e".
2. En cada tubo echamos una gota de antisuero corrspondiente y una gota de suspensión de hematíes.
3. Centrifugamos a 1000rpm durante 1 minuto.
4. Golpear el fondo de los tubos suavemente y observar la presencia o no de algutinación.
Lectura de los resultados:
-En nuestro caso, los resultados han sido:
·Tubo "D"=Aglutinación
·Tubo "C"=No aglutinación
·Tubo "E"=Aglutinación
·Tubo "c"=Aglutinación
·Tubo "e"=No aglutinación
Práctica 47: Determinación del grupo Rh en tubo.
Fecha: 5-5-15
Determinación del grupo Rh en tubo.
Introducción:
- Igual que en la prueba en portaobjetos, intentamos poner de manifiesto la presencia de antígeno D en la superficie de los hematíes mediante su enfrentamiento a un suero anti-D.
Material:
-Tubos de hemólisis.
-Rotulador de vidrio.
-Visualizador luminoso.
-Gradilla.
-Pipetas pasteur.
-Vasos de precipitados para desechar.
-Centrífuga.
-Pipeta graduada.
-Papel parafilm.
Reactivos:
-Suero anti-D.
-Albúmina bovina al 30%.
-Solución salina fisiológica al 0,9%.
Muestra:
-Hematíes problema preparados en suspensión al 5% (Pincha aqui para saber como se preparan)
Fundamento:
-La técnica esta basada en la detección del antígeno D sobre la superficie de los hematíes problema, empleado como reactivo un suero monoclonal humano que contiene anticuerpos anti-D. En el caso de que los hematíes contengan el antígeno D se producirá una aglutinación que puede observarse a simple vista.
Procedimiento:
1. Preparar la muestra, esto se hace mezclando sangre problema con suero salino a partes iguales, centrifugar a 2000rpm durante cuatro minutos, desechamos el sobrenadante y depositamos suero fisiológico a la misma cantidad de hematíes concentrados, esto se realizar hasta completar tres centrifugados.
2. En un tubo de ensayo depositamos 5ml de suero fisiológico y cinco gotas del concentrado de hematíes, homogenizar y ya tenemos la muestra preparada.
3. Rotulamos dos tubos, un con una "D" y otro con una "A".
4. En el tubo D añadimos una gota de suero anti-D y en el tubo A añadimos una gota de albúmina bovina.
5. A cada tubo le añadimos una gota de la suspensión de hematíes al 5% y agitamos suavemente y tapamos con papel parafilm.
6. Centrifugamos a 1000rpm durante un minuto o 3500rpm durante 30 segundos.
7. Golpeamos suavemente el fondo de los tubos para despegar el botón hemático y observamos la presencia o no de aglutinación.
Lectura de los resultados:
-Si el tubo D presenta aglutinación y el tubo A no, decimos que es Rh positivo.
-Si no se produce aglutinación en ninguno de los dos, se procede a incubar ambos a 37ºC durante media hora y posteriormente centrifugamos a 1000rpm durante 1 minuto, se observa si existe aglutinación o no.
-En caso de persistir la negatividad cromprobaremos que el paciente no posee un Du (D debíl) mediante una prueba de Coombs indirecta.
-Si sigue siendo negativo, la muestra se tratará de Rh negativo.
Práctica 46: Determinación del grupo Rh en porta. (PLIX)(B4)
Fecha: 5-5-15
Determinación del grupo Rh en porta.
Introducción:
-Al igual que podemos determinar el grupo AB0, también podemos determinar el grupo Rh, tanto en porta como en tubo. En porta, la aglutinación se ve favorecida por la exposición al calor.
Material:
-Portaobjetos.
-Pipetas pasteur.
-Rotulador de vidrio.
-Palillos ajitadores.
-Visualizador luminoso.
-Lancetas.
-Gasas.
Reactivos:
-Alcohol.
-Suero anti-D.
-Albúmina bovina al 30%.
Muestra:
-Sangre capilar o sangre total anticoagulada.
Fundamento:
-La técnica esta basada en la detección del antígeno D sobre la superficie de los hematíes problema, empleado como reactivo un suero monoclonal humano que contiene anticuerpos anti-D. En el caso de que los hematíes contengan el antígeno D se producirá una aglutinación que puede observarse a simple vista.
Procedimiento:
1. Dividir el portaobjetos en dos seciones con el rotulador de vidrio, una zona será "S" de suero y la otra zona será "A" de albúmina.
2. Colocaremos una gota de sangre en cada zona y posteriormente dos gotas del suero anti-D en la zona "S" y, dos gotas de albúmina en la zona "A".
3. Mezclamos con un palillo distinto a cada zona.
4. Colocamos el porta sobre el visualizador luminoso y lo balanceamos para favorecer la mezcla.
5. Observar la presencia o no de aglutinación.
Lectura de los resultados:
Práctica 45: Determinación sérica del grupo AB0. (PLVII) (B4).
Fecha: 27-4-15
Determinación sérica del grupo AB0.
Introducción:
La clasificación correcta del grupo sanguíneo en la sangre del donante y del receptor es un paso fundamental en el acto transfusional. Por ello, es imprescindible confirmar el resultado de la prueba celular con la determinación sérica del grupo sanguíneo.
Material:
-Tubos de hemólisis(se aprecia mejor la reacción positiva).
-Pipetas pasteur.
-Baño de agua.
-Centrífuga.
-Reloj.
-Rotulador de vidrio.
-Gradilla.
-Papel parafilm.
-Visualizador luminoso.
-Papel parafilm.
-Visualizador luminoso.
Reactivos:
-Solución de hematíes del grupo A1 al 2%.
-Solución de hematíes del grupo A2 al 2%.
-Solución de hematíes del grupo B al 2%.
-Solución de hematíes del grupo 0 al 2%.
-Solución de hematíes de la sangre problema al 2%.
Muestra:
-Plasma obtenido a 3000rpm durante 10 minutos.(En nuestro caso, fueron 4 sueros diferentes obtenidos por centrifugación de sangre coagulada y, posteriormente lo realizamos con plasma).
Fundamento:
-El suero de un individuo solo debe contener anticuerpos frente a los antígenos que no están presentes en sus propios hematíes. Por ellos, al hacer reaccionar este suero con hematíes conocidos del grupo A y del grupo B, solo producirá aglutinación en el caso de ser enfrentado a eritrocitos con antígenos distintos a los de sus propios hematíes.
Procedimiento:
1. Rotular cuatro tubos de hemólisis:
-Tubo 1: "A1"
-Tupo 2: "A2"
-Tubo 3: "B"
-Tubo 4: "C"(en este caso, no lo hicimos en clase, ya que el profesor nos proporcionó cuatro "sueros" problema y nosotros debíamos averiguar de que tipo eran cada uno)(Este tubo se utilizará de control negativo).
2. Depositar dos gotas de suero problema (En nuestro caso fue suero obtenido de sangre coagulada) posteriormente incubado a 56ºC durante 10 minutos, en todos los tubos. Si se trata de plasma no se incuba.
3. Añadirles una gota de suero salino a todos los tubos.
4. Mover suavemente los tubos y centrifugar a 1000rpm durante 1 minuto.
5. Golpear el fondo de los tubos con los dedos y observar si hay presencia o no de aglutinación, si hay presencia de aglutinación, significa que el "Plasma/suero" problema ha reaccionado contra los antígenos de la suspensión de hematíes del grupo sanguíneo correspondiente.
Lectura de los resultados:
-El suero problema 1 nos ha salido A2 y teóricamente debería de salir A1.
-El suero problema 2 nos ha salido B, teóricamente debería de salir 0.
-El suero problema 3 nos ha salido A1 y teóricamente debería de salir B.
-El suero problema 4 nos ha salido B, teóricamente debería de salir A2.
-Viendo que los resultados no eran los esperados, debemos buscar el error, un posible error puede ser el de la solución al 2% de hematíes en vez de al 5%.
Práctica 44: Preparación de suspensión de hematíes tipados
Fecha:24-4-15
Preparación de suspensión de hematíes tipados.
Introducción:
-Con esta práctica podremos elaborar suspensiones de hematíes al porcentaje deseado, tras su lavado, para posteriores pruebas diagnósticas.
Materiales:
-Tubos de centrífuga.
-Gradilla.
-Centrífuga.
-Pipetas pasteur.
-Rotulador de vidrio.
Reactivos:
-Suero salino 0,9%.
Muestra:
-Sangre total anticoagulada.
Fundamento:
-Con esta práctica podremos elaborar suspensiones de hematíes al porcentaje deseado, tras su lavado, para posteriores pruebas diagnósticas.
Procedimiento:
1. Tomar 1ml de sangre de un grupo sanguíneo conocido y completar con 3ml de solución salina.
2. Centrifugar a 2000rpm durante 4 minutos.
3. Retirar el sobrenadante.
4. Repetir dos veces más, en total serán tres lavados.
5. Preparar hematíes al 2% (2 gotas de hematíes + 5ml de suero salino).
6. Realizar el mismo procedimiento con los restantes grupos sanguíneos diferentes.
Práctica 43: Determinación celular en tubo. (PLVI)(B4)
Fecha:23-4-15
Determinación celular en tubo.
Introducción:
Material:
-Tubos de centrífuga.
-Rotulador de vidrio.
-Pipetas pasteur.
-Centrífuga.
-Gradilla.
-Visualizador luminoso.
-Papel parafilm.
-Visualizador luminoso.
-Papel parafilm.
Reactivos:
-Suero salino al 0,9%.
-Suero Anti-A.
-Suero Anti-B.
-Suero Anti-AB.
Muestra:
-Sangre total anticoagulada, un lavado de hematíes.
Fundamento:
-Los hematíes problema contienen las sustancias antigénicas del sistema AB0 y se enfrentan a sueros conocidos que poseen anticuerpos frente a esos antígenos. El resultado final es la presencia o no de aglutinación en los hematíes reaccionantes.
Procedimiento:
1. Vertir 1ml de sangre + 2,5ml de suero salino en un tubo de centrífuga y centrifugar durante 4 minutos a 2000rpm.
2. Desechar el sobrenadante con una pipeta pasteur.
3. Depositar 100microlitros (2 gotas) + 5ml de suero salino y homogenizar, ahi tendremos una suspensión de hematíes al 2%.
4. Depositar una gota de esta mezcla en tres tubos de centrifuga rotulados como "A", "B" y "AB" + dos gotas de su antisuero correspondiente.
5. Centrifugar a 1000rpm durante 1 minuto.
6. Golpeamos suavemente el fondo del tubopara desprender el sedimento, y se observa microscopicamente la presencia o ausencia de aglutinación.
Lectura de los resultados:
-La reacción será negativa si los hematíes se resuspenden homogéneamente, y al contrario, será positiva si se observa un botón de hematíes que permanecen unidos una vez desprendido el sedimento.
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