Práctica 50: Determinación de un Du. (PLXII)(B4).

Fecha: 20-5-15

Determinación de un Du.

Introducción:

-En algunos casos los anticuerpos tipo IgG son incapaces de producir la aglutinación de los hematíes. Sin embargo, son capaces de adherirse a su superficie y decimos que han sensibilizado a los hematíes.

-El suero de Coombs, suero extraído de conegos con anticuerpos IgM humana, puede ser poliespecifico, si está dirigido contra la IgG y contra el componente C3d del complemento o monoespecífico, si está dirigido contra la IgG o contra alguno de los componentes del complento.

Material:

-Tubos de hemólisis.

-Centrífuga.

-Pipetas pasteur.

-Gradilla.

-Baño de agua.

-Reloj.

-Visualizador luminoso.

Reactivos:

-Suero anti-D humano.

-Suero antiglobulila humana (suero de Coombs).

-Suero salino.

Muestra: 

-Hematíes de sangre problema previamente lavados y suspendidos a 5%.

Fundamento:

-El test de Coombs puede realizarse de dos maneras:

-Prueba directa: Intentamos detectar anticuerpos incompletos que han sensibilizado a los hematíes, los enfrentamos diréctamente al suero de Coombs y observamos.

-Prueba indirecta: Primero se sensibilizan los hematíes y luego los hacemos reaccionar con el suero de Coombs. Buscamos anticuerpos incompletos libres o poner de manifiesto la presencia de antígenos débiles en la membrana de los hematíes.

Procedimiento:

1. En un tubo de hemólisis vertimos una gota de  suero anti-D y una gota de la suspensión de hematíes problema.

2. Mezclamos e incubamos a 37ºC durante 30 minutos.

3. De mientras podemos hacer un control negativo(para evitar falsos positivos), consiste un Coombs directo, se vierte una gota de la suspensión + una gota de suero de Coombs en un tubo de hemólisis, centrifugar a 1000rpm durante 1 minuto y ver los resultados.

4. Una vez incubada la muestra, lavamos la solución con 2ml de suero salino x3 veces a 1000rpm durante 1 minuto.

5. Decantamos el sobrenadante y añadimos una gota de suero de Coombs.

6. Centrifugamos a 1000rpm durante 1 minuto.

7. Leer los resultados.

Lectura de los resultados:

-Si existe aglutinación, el resultado es +, indíca que en la membrana de los hematíes hay antígenos Du y se clasifica la sangre como Rh+ variante Du. Si no existe aglutinación, se considera Rh -.

Práctica 49: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Fecha: 13,14 y 15 de mayo de 2015

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Introducción:

-La PCR es una técnica biología molecular desarrollada en 1986 por Kary Mullis. Su objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento de ADN (amplificar), partiendo de un fragmento original, utilizándolo como molde.

-La utilidad que presenta es que tras la amplificación resulta más fácil con una alta probabilidad, la identificación de virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas o simplemente con fines divulgativos.

Material:

-Palillos.

-Tubos de ensayo.

-Gradillas.

-Eppendorf para PCR/ microtubos.

-Centrífuga de microtubo.

-Placa calefactora para microtubo.

-Micropipetas con punta de pipetas.

-Pipetas pasteur.

-Congelador.

-Termociclador.

-Matraz aforado.

-Vasos de precipitado.

-Varilla de vidrio.

-Microondas.

-Fuente de poder y Materiales para electroforesis.

-Visualizador de luz ultravioleta.

-Balanza.

-Vidrio de reloj y cucharilla.

Reactivos:

-Solución salina 0,9%.

-Resina InstaGene Matrix de Bioser.

-Tampón TAE.

-Gel de Agarosa en polvo.

-Oligonucleòtidos.

-PureTaq Ready To Go PCR.

-Marcador de peso molecular.

-Intercalante para ADN(Bromuro de etidio o similar, en clase, es lógico que no se utilizase este producto, debido a su alto nivel de mutagenidad, así que usaremos uno menos peligroso, en nuestro caso, fueron dos).

-Agua destilada.

Muestra:

-ADN procedente de la mucosa bucal.

Fundamento:

-Esta práctica tan laboriosa, consta principalmente de tres fases: Aislamiento de ADN, PCR y Electroforesis. El objetivo de esta práctica es demostrar la existencia de polimorfismo en un locus concreto mediante el método de amplificación por PCR.

Procedimiento:

1. Enjuagar la boca.

2. Con un palillo, intentaremos arrastrar la mayor parte dela mucosa de la boca, con cuidado de no hacernos daño.

3. Depositamos 5 ml de suero salino en un tubo de ensayo e introducimos el palillo por la parte de la mucosa y removemos durante unos tres minutos.

4. En un microtubo o un eppendorf depositamos 1,4ml de la solución anterior + 3ml de suero salino.

5. Centrifugamos a 8000rpm durante 5 minutos.

6. Decantamos el sobrenadante, evitando que se distorsione el precipitado celular.

7. Le añadimos 70microlitros al eppendorf con el precipitado de células y resuspendemos con la punta de micropipeta.

8. Incubamos la muestra en la placa calefactora a 100ºC durante 10 minutos.

9. Dejar enfriar a temperatura ambiente unos 2 minutos.

10. Centrifugamos a 1300rpm durante 30 segundos.

11. Tranferir 10 microlitros de sobrenadante a un eppendorf.

12. Se puede guardar la muestra en el congelador hasta el siguiente procedimiento.

13. Comenzaremos con la PCR, añadir a el eppendorf que contiene una bolita de Ready To Go:

-18,5 microlitros de agua destilada(a ser posible estéril).

-2 microlitros de oligo 1(Primers).

-3 microlitros de oligo 2(Primers).

-2,5 microlitros de ADN ya obtenido previamente.

14. Centrifugamos (Un toque).

15. Depositamos nuestro eppendorf en el termociclador y dejar que éste trabaje.

16. Preparar un gel de Agarosa, pesar 1,5g de agarosa en polvo y mezclar con 27 ml de agua destilada y 10ml de tampón TAE.

17. Mezclar y calentar en el microondas hasta que desaparezca por completo la turbidez.

18. Dejar enfriar y vertir 5microlitros de colorante.

19. Vertir la mezcla en la bandeja de electroforesis y poner el molde de los pocillos, dejar enfriar y retirar los moldes con cuidado.

20. Depositar en los pocillos de los extremos el control.

21. Como son 10 microlitros en total los que tenemos que depositar en cada pocillo, cogeremos 5microlitros de nuestro ADN ya amplificado + 5microlitros de tampón de carga.

22. Tapar la cubeta de electrofoseris y conectar a la corriente a 120 voltios durante 30 minutos.

23. Observar los resultados con luz ultravioleta con cuidado por que puede dañar la vista.

Lectura de los resultados:

-Se observaría una cosa así: 

Si no te gusta leer, y prefieres algo más divertido, clicka en el siguiente video y te esplicará como realizar una PCR de manera divertida ;)

https://www.youtube.com/watch?v=AJXfpaaC5eU

Práctica 48: Determinación del fenotipo y genotipo del sistema Rh. (PLXI)(B4).

Fecha: 7-5-15

Determinación del fenotipo y genotipo del sistema Rh.

Introducción:

-El genotipo de una persona es su dotación genética en el cromosoma, y el fenotipo es la manifestación de ese genotipo. En caso de los sistemas del grupo sanguíneo se puede considerar el fenotipo como la suma total de antígenos detectados en los hematíes mediante el empleo de antisueros específicos.

Material:

- Tubos de hemólisis.

-Visualizador luminoso.

-Papel parafilm.

-Rotulador de vidrio.

-Pipetas pasteur.

-Centrífuga.

-Gradilla.

Reactivos:

-Suero anti-D.

-Suero anti-E.

-Suero anti-C.

-Suero anti-e.

-Suero anti-c.

-Suero fisiológico.

Muestra:

-Suspensión de hematíes lavados al 5% en solución salina.

Fundamento:

-Podemos investigar el genotipo del sistema Rh enfrentando los hematíes problema a distintos antisueros dirigidos contra los antígenos que componen el sistema Rh.

Procedimiento:

1. Rotulamos cinco tubos "D","C","E","c" y "e".

2. En cada tubo echamos una gota de antisuero corrspondiente y una gota de suspensión de hematíes.

3. Centrifugamos a 1000rpm durante 1 minuto.

4. Golpear el fondo de los tubos suavemente y observar la presencia o no de algutinación.

Lectura de los resultados:

-En nuestro caso, los resultados han sido:

·Tubo "D"=Aglutinación

·Tubo "C"=No aglutinación

·Tubo "E"=Aglutinación

·Tubo "c"=Aglutinación

·Tubo "e"=No aglutinación